Die anstehende Neuordnung der europäischen Chemikalienbewertungspolitik
(REACH) hat zu kontroversen Diskussionen hinsichtlich der zusätzlich
erforderlichen Tierversuche geführt. Um steigende Tierversuchszahlen zu
vermeiden sowie zur Zeit- und Kostenersparnis, werden tierversuchsfreie
Alternativen zur Erfassung toxischer Effekte befürwortet. Der Entwurf
der Verordnung vom 29. Oktober 2003 (EU, 2004) sieht einen Einsatz
derartiger Methoden vor, ohne sie allerdings genauer zu spezifizieren.
Insbesondere im Bereich der kosmetischen Mittel wird seit 1986 auf
EU-Ebene das Ziel verfolgt, Alternativen zu Tierversuchen zu entwickeln
und so das Leiden und die Zahl der benötigten Tiere zu verringern.
Tierversuche sollen durch "wissenschaftlich zufrieden stellende
Alternativen" ersetzt werden, wenn sie den Verbrauchern ein
"gleichwertiges Schutzniveau" bieten (EU 1986; EU 1993; EU, 2003). Mit
der Änderungsrichtlinie 2003/15/EG werden vom Europäischen Parlament
und vom Rat Termine festgeschrieben, bis zu denen Tierversuche gänzlich
durch alternative Methoden ersetzt werden sollen: Tierversuche im
Zusammenhang mit Toxizität nach wiederholter Verabreichung,
Reproduktionstoxizität und Toxikokinetik bis März 2013, alle anderen
bis März 2009 (EU, 2003).
Die DGPT-Beratungskommission hat diese aktuelle Diskussion zum Anlass genommen, eine
Stellungnahme zum Thema computergestützte Vorhersagesysteme in der
Toxikologie zu verfassen. Es soll dabei zunächst eine
Begriffsbestimmung vorgenommen werden, um dann auf Einsatzgebiete
derartiger computergestützter Vorhersagemodelle, deren Grenzen und
mögliche zukünftige Entwicklungen einzugehen.
Begriffsbestimmungen
Neben dem Begriff "computergestützte Vorhersagemodelle" werden synonym
auch die Bezeichnungen "in silico toxicology" oder "predictive tools"
verwendet. Allen hierunter zusammengefaßten Modellen liegt die
Erstellung einer Struktur-Aktivitätsbeziehung (structure-activity
relationship, SAR) zugrunde, also die Feststellung von Zusammenhängen
zwischen chemischen Strukturen von Substanzen oder Substanzklassen und
den durch diese in biologischen Systemen ausgelösten Effekten. Eine
genauere Betrachtung der Funktionsweise der Modelle erlaubt die
Differenzierung in Expertensysteme einerseits, welche in ihrer Reinform
lediglich qualitative Vorhersagen treffen, (Ja/Nein Antwort) und
quantitative Struktur-Aktivitäts-basierte Systeme (QSAR) andererseits,
welche die Größe des zu erwartenden Effektes vorhersagen.
Expertensysteme beziehen ihren Namen aus der Tatsache, dass hier
Fachwissen in ein computerisierbares Regelwerk überführt wurde. Die
Vorgehensweise ist dabei vergleichbar mit der Erstellung eines
Gutachtens über eine bestimmte Substanz- oder Strukturklasse:
Verfügbare Information wird gesammelt, bewertet und gewichtet und dann
nach struktureller Ähnlichkeit der Substanzen sortiert. Danach wird die
Strukturinformation in eine maschinenlesbare Sprache übersetzt und mit
den entsprechenden Informationen über die Substanzen zu einer Datenbank
verknüpft ("knowledge base"). Das System ist dann in der Lage neue
Substanzen auf das Vorkommen von toxikologisch relevanten Strukturen zu
überprüfen. Auf der Basis des gesammelten Vorwissen geben
Expertensysteme meistens auch Auskunft über den Mechanismus eines
Effektes. Der Nutzer ist daher auf der Basis dieser Informationen in
der Lage die Relevanz des Warnhinweises, der vom System gegeben wird,
zu bewerten. Eine Aussage über das quantitative Ausmaß eines Effektes
liefern Experten-Systeme jedoch in der Regel nicht.
QSAR-Systeme hingegen beruhen auf einer statistischen Korrelation
zwischen der chemischen Struktur eines Moleküls und dessen biologischen
Effekten. Dabei wird bestimmten chemischen oder physikochemischen
Eigenschaften, die aus der Struktur der Substanz abzuleiten sind
(sogenannte Deskriptoren wie z.B. Elektronendichteverteilung,
Polarität, Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizient u.ä.), das
quantitative Ausmass eines biologischen bzw. toxischen Effektes
zugeordnet und daraus eine Korrelationskurve oder Regressionsgerade
errechnet. Im Gegensatz zu Expertensystemen liefern QSAR-Systeme daher
eine quantitative Aussage über das Ausmaß eines Effektes. Eine
Übersicht über derzeit marktgängige Systeme beider Kategorien findet
sich in Greene (2002) und ECETOC (2003).
Beiden Kategorien ist gemeinsam, dass sie auf Datensätzen basieren, die
zuvor aus entsprechenden experimentellen in vitro oder in vivo
Prüfungen oder entspechenden Beobachtungen an Menschen für den
jeweiligen toxikologischen Endpunkt gewonnen wurden. Die Qualität
dieser Datensätze beeinflusst damit unmittelbar die Güte der
Vorhersage. Vorhersagesysteme, die aus Datensätzen minderer Qualität
abgeleitet werden, resultieren zwangsläufig in mäßigen oder falschen
Vorhersagen.
In der Toxikologie wird in der Regel von in vitro oder
tierexperimentellen in vivo Prüfungen auf Effekte am Menschen
extrapoliert, d.h. bereits hier wird eine Vorhersage getroffen, deren
Trefferwahrscheinlichkeit keine 100 % erreichen wird. Im Falle von
Industriechemikalien verbieten sich toxikologische Prüfungen am
Menschen in der Regel aus ethischen Gründen. Aus prinzipiellen
Überlegungen ist daher davon auszugehen, dass die
Trefferwahrscheinlichkeit eines computergestützten Vorhersagemodells im
Idealfall lediglich den Wert des entsprechenden experimentellen Systems
zur Vorhersage von Effekten am Menschen annehmen kann. In der Realität
wird sie mehr oder weniger deutlich darunter liegen.
Welche toxikologischen Endpunkte sind einer Vorhersage zugänglich?
Theoretisch können Datensätze zu jedem toxikologischen Endpunkt einer
statistischen Analyse unterworfen werden, mit dem Ziel eine neue Regel
für ein Expertensystem bzw. eine quantitative Beziehung zwischen
Struktur und Wirkung abzuleiten. Wenn der toxische Effekt idealer Weise
auf einen bekannten Mechanismus zurückgeführt werden kann, kann eine
solche statistische Analyse erfolgversprechend sein. Wenn der Effekt
jedoch von einer Vielzahl unterschiedlicher Mechanismen ausgelöst
werden kann, so wird eine statistische Korrelation ohne
Berücksichtigung der jeweiligen Mechanismen zumindest bei dem
derzeitigen Stand der Vorhersagetechniken zu fehlerhaften Intra- und
Extrapolationen und daraus resultierend zu nicht verlässlichen
Vorhersagen führen.
Mit den heute verfügbaren kommerziellen Systemen werden beispielsweise
bereits akzeptable Vorhersagen für den Bereich Mutagenität erzielt
(White et al. 2003). Als "akzeptabel" sind dabei Vorhersagen zu werten,
die für die weiter unten definierten Parameter "Sensitivität",
"Spezifität" oder "Konkordanz" Werte über 70% liefern. Vergleichsweise
gute Vorhersagen werden insbesondere für mutagene Effekte beobachtet,
die auf dem Mechanismus kovalenter DNA-Bindung beruhen, deren Folge im
Ames-Test als somatische Mutation detektiert wird. Zwei Gründe können
für die gute Prädiktivität im Vergleich zu anderen toxikologischen
Endpunkten angeführt werden. Zum einen liegen für diesen einfach
durchzuführenden und standardisierten Test umfangreiche Datensätze vor,
d.h. eine Vielzahl unterschiedlichster Moleküle wurde charakterisiert.
Zum anderen handelt es sich hier um einen toxikologischen
Wirkmechanismus, der sich annähernd aus den Moleküleigenschaften
ableiten lässt: die DNA-Reaktivität steht im Zusammenhang mit der
elektrophilen Natur eines Moleküls bzw. dessen Metaboliten, welche sich
wiederum aus der Struktur erschließen lässt. Voraussetzung ist
allerdings, dass die Metabolisierungswege der Substanz bekannt sind
oder ihrerseits verläßlich vorhergesagt werden können. Die Vorhersage
von mutagenen Effekten, die nicht auf DNA-Schädigung durch kovalente
Bindung zurückzuführen sind ( bei klastogenen oder aneugenen
Substanzen), ist jedoch deutlich weniger verlässlich (Snyder et al.
2004). Hier ist auch der Mechanismus weniger eindeutig von der Struktur
ableitbar bzw. in vielen Fällen nicht bekannt. Ähnlich wie DNA-Reaktivität gibt es noch andere toxische Effekte, die
sich auf bestimmte physikalisch-chemische Eigenschaften eines Moleküls
zurückführen lassen. Beispielsweise wurden Wasser- oder
Fettlöslichkeit, Dampfdruck und Oberflächenaktivität als Parameter
identifiziert, die zu lokalen Effekten (Reizung) an Haut oder Auge
beitragen (Gerner et al., 2000). Des weiteren ist Proteinreaktivität
eine Ursache für die Bildung von allergenen Haptenen im Rahmen der
Hautallergenisierung (Kimber et al., 2001). Allerdings spielt hier auch
die Hautresorption als zweiter Parameter eine entscheidende Rolle, die
wiederum maßgeblich durch die physikalisch-chemischen Eigenschaften
Molekülgröße und Fettlöslichkeit bedingt ist. Durch Kombination
geeigneter Vorhersagesysteme für Resorption und Reaktivität lassen sich
auch für diesen Endpunkt akzeptable Vorhersagen erzielen (Barratt 2001).
Endpunkte wie akute Toxizität oder Letalität, chronische Toxizität,
Kanzerogenität, Reproduktionstoxizität oder Organtoxizität sind einer
Modellierung nur bedingt zugänglich, da die im Versuch erhobenen
Beobachtungen eine Vielzahl unterschiedlicher Variabeln betreffen und
über verschiedenste Mechanismen ausgelöst werden können. Darüber hinaus
ist für solche Endpunkte die Datenlage, d.h. die Zahl verfügbarer
valider Studien sowie die Variabilität der untersuchten chemischen
Strukturen, limitiert, so dass ein universell anwendbares
Vorhersagesystem für solche Endpunkte derzeit nicht verfügbar ist.
Lebertoxizität, zum Beispiel, zeigt sich bereits histopathologisch in
verschiedensten Erscheinungsbildern, die kaum in einem generellen
Vorhersagemodell abgebildet werden können. Daher existieren dazu bisher
keine verlässlichen QSAR Systeme. Für den speziellen Mechanismus der
speziesspezifischen Peroxisomenproliferation in der Leber wurden
hingegen mittlerweile einige taugliche Struktur-Aktivitätsbeziehungen
aufgestellt. Da die Peroxisomenproliferation rezeptorvermittelt ist,
ist die Rezeptorbindung eine wesentliche Voraussetzung für das
Eintreten des toxischen Effektes. Die Bindungstasche ist ihrerseits
durch die bekannten Proliferatoren annähernd charakterisiert, so dass
die Aufstellung von Struktur-Wirkungsbeziehungen auf dieser Basis
möglich ist (Ashby et al. 1994).
Generell spielt die Reproduzierbarkeit der experimentellen Ergebnisse
sowie die experimentelle Variabilität der Effekte eine entscheidende
Rolle für die Entwicklung von validen Vorhersagemodellen. Der hohe Grad
an Variabilität bei Kanzerogenitätsstudien mit Nagern wird beim
Vergleich der Ergebnisse von NTP1-Kanzerogenitätstudien mit Ergebnissen
aus nicht-standardisierten Prüfungen deutlich. Dabei wurde für einen
Datensatz von >100 Chemikalien eine Reproduzierbarkeit <60%
gefunden (Gottmann et al, 2001). Darüber hinaus bestehen Unterschiede
bei der Beurteilung der kanzerogenen Effekte (positives oder negatives
Ergebnis) und der biologischen Signifikanz der Effekte zwischen
verschiedenen Untersuchern, da hier weniger eindeutige Kriterien als
beispielsweise bei der Beurteilung der Mutagenität im Ames-Test
vorliegen. Dieses zeigt die Bedeutung der Qualität der experimentellen
Daten sowie international einheitlicher Bewertungskriterien für die
Auswahl der Studien im Rahmen der Modellentwicklung. Modelle, die auf
Daten aus nicht-standardisierten Tests oder auf Daten geringer Qualität
basieren, werden kaum verlässliche Vorhersagen liefern können.
In Anbetracht der strukturellen Vielfalt chemischer Verbindungen und
der großen Zahl möglicher Mechanismen, die bei Langzeitbehandlung von
Nagern zu Tumoren führen können, in Verbindung mit dem Fehlen von Daten
für große Bereiche des "chemischen Universums" ist es fraglich, ob die
derzeitigen Daten ausreichend als Basis für ein generelles
Vorhersagemodell sind. Für Substanzklassen mit gemeinsamem
Wirkmechanismus oder ähnlicher chemischer Struktur (kongenere
Chemikalien) ist eine erfolgreiche Modellentwicklung jedoch möglich.
Die Entwicklung von SARs für große, heterogene Datensets wird allgemein
als sehr schwierig angesehen (Richard & Benigni, 2001; Benigni
& Passerini, 2002; Clark & Grootenhuis, 2002).
Wie wird die Vorhersagekraft ermittelt?
(Verhältnis der korrekt vorhergesagten
toxischen Substanzen zur Gesamtzahl der toxischen Substanzen) und
Spezifi
Die Beurteilung der Vorhersagequalität erfolgt maßgeblich auf der Basis
der Parameter Sensitivitättät (Verhältnis der korrekt vorhergesagten nicht-toxischen
Substanzen zur Gesamtzahl der nicht-toxischen Substanzen) bzw. auf dem
zusammengefassten Parameter Konkordanz (Verhältnis der korrekt
vorhergesagten Substanzen zur Gesamtzahl der getesteten Substanzen;
synonym als "Richtigkeit", im englischen auch als "accuracy"
bezeichnet) (ECETOC, 2003; Steger-Hartmann, 2004). Eine Optimierung der
Vorhersagesysteme in Richtung Sensitivität hat in der Regel eine
verringerte Spezifität zur Folge. Für die Vorhersage von Mutagenität
heißt dies, dass zwar mehr Substanzen korrekt als Mutagene
identifiziert werden, andererseits aber auch die Zahl derer ansteigt,
die fälschlicherweise als Mutagene vorhergesagt werden. Je nach
Einsatzgebiet muss entschieden werden, welcher der beiden Parameter
optimiert werden soll. In der frühen Arzneimittelentwicklung
beispielsweise ist eine hohe Spezifität anzustreben, da hier jede
falsch positive Vorhersage zu einem Verlust eines wertvollen
potentiellen Entwicklungskandidaten führen würde, der in jedem Falle zu
einem späteren Zeitpunkt einer ausfährlichen experimentellen Prüfung
unterliegt. Im regulatorischen Kontext (Sicherheitsbewertung bisher
nicht experimentell überprüfter Substanz, Verbraucherschutz) ist
dagegen eher eine optimierte Sensitivität gewünscht, da jede falsch
negative vorhergesagte Substanz, für die nicht die entsprechenden
Konsequenzen getroffen werden, ein Risiko für den Anwender oder
Verbraucher darstellt.
Sensitivität und Spezifität können nicht als absolute Zahlen für ein
einzelnes System angegeben werden, sondern sind abhängig vom
Testdatensatz, mit dem das System geprüft wird. Diese Feststellung ist
im Prinzip vergleichbar mit der in den achtziger Jahren gemachten
Beobachtung, dass die Sensitivität des Ames-Tests für die Vorhersage
der Karzinogenität am Nager von 90% auf 45% fiel, nachdem sich die
zugrundeliegende NTP-Datenbasis von chemisch-hochreaktiven Substanzen
zu Verbindungen verschob, die primär aufgrund ihrer Umweltrelevanz
getestet wurden (Ashby und Tennant, 1988). Die in der erwähnten
Publikation auf der Basis der NTP-Daten aufgestellten sogenannten
"structural alerts" haben Eingang in die meisten Experten-Systeme
gefunden. Eine Validierung eines Systems auf der Basis der
NTP-Datenbank führt daher zu akzeptablen Werten für Sensitivität und
Spezifität. Wird diese Validierungsübung hingegen mit einem anderen
Datensatz, z.B. mit zugelassenen Arzneimitteln, durchgeführt, so fallen
die Ergebnisse deutlich schlechter aus (Snyder et al. 2004). Die
Qualität eines Vorhersagesystems hängt somit maßgeblich davon ab,
inwieweit zu testende Verbindungen bereits durch verwandte Verbindungen
im System abgebildet sind ("coverage"). Bedauerlicherweise lässt sich
dies derzeit noch nicht durch einen Zahlenwert darstellen, der die
Vergleichbarkeit von Systemen verbessern würde. Ein Vergleich von
Sensitivitäts- und Spezifitätsangaben zwischen Systemen ist daher nur
auf der Basis identischer Testdatensätze möglich.
Werden computergestützte Vorhersage-Systeme Tierversuche einsparen?
Eine wesentliche Einsparung von Tierversuchen durch die alleinige
Verwendung von computergestätzten Vorhersagesystemen ist in naher
Zukunft nicht zu erwarten. Wie oben geschildert, ist die Mehrzahl der
toxischen Effekte derzeit noch schlecht vorherzusagen. Allerdings ist
davon auszugehen, dass computergestätzte Vorhersagesysteme für einige
mechanistisch klarer umrissene Endpunkte mit guter Datenbasis (ätzende
Wirkung, Reizung) in Zukunft ihren festen Platz in einem abgestuften
Prüfverfahren haben werden (Gerner & Schlede, 2002; Häfer et al.
2004). Sinn dieser abgestuften Verfahren ist es, eindeutig positiv
vorhergesagte und von einem Experten ebenfalls so bewertete Substanzen
nicht der experimentellen Testung zu unterziehen, sondern nur mehr die
als unwirksam vorhergesagten Substanzen tierexperimentell zu
überprüfen, um einen optimalen Verbraucherschutz zu gewährleisten.
Damit würde zumindest die Zahl der Tiere verringert.
Was ist der derzeitige Stellenwert von computergestätzten Vorhersage-Systemen in der Risikobewertung?
Wie bereits oben geschildert, wird von den EU-Behörden angestrebt, dass
für einige toxische Endpunkte computergestätzte Vorhersagesysteme ihren
festen Platz im Rahmen abgestuften Prüfverfahren bekommen werden.
Allerdings bedarf es dazu noch erheblicher Entwicklungsanstrengungen,
bis von in silico Methoden als verlässlichen und validierten
Ersatzmethoden gesprochen werden kann.
Zusammenstellungen über die derzeit bei internationalen
Entscheidungsträgern/Behörden verwendeten (Q)SAR-Modelle sind bei
Walker et al. (2002) oder Cronin et al. (2003) zu finden. Eine weite
Verbreitung hat die Verwendung von Strukturanalogien bei der Bewertung
von Chemikalien gefunden. So werden z.B. in der EU, Korea und USA bei
der Anmeldung neuer Chemikalien Analogiebetrachtungen zu strukturell
ähnlichen Substanzen anerkannt und können zu einem eingeschränkten
(öko)-toxikologischen Prüfprogramm und somit zur Reduktion von
Tierversuchen führen. Im Technical Guidance Document on Risk Assessment
der EU (ECB, 2003) wird für ökotoxikologische Endpunkte eine Vielzahl
von Einsatzmöglichkeiten von (Q)SARs beschrieben. Für toxikologische
Endpunkte wird der Einsatz von Struktur-Wirkungsbeziehungen im
wesentlichen auf "expert judgement" beschränkt, welches dann als
zusätzlicher Hinweis gewertet wird. Deutlich weiter geht die dänische
Umweltbehörde Danish EPA mit dem Einsatz von QSAR-Systemen. In einem
umfangreichen Programm wurden für ca. 47.000 chemische Stoffe
Vorhersagen zu toxikologischen Endpunkten (akute und subchronische
Toxizität, Mutagenität, Kanzerogenität, Reproduktionstoxizität) mit
computerbasierten QSAR-Systemen ermittelt. Basierend auf diesen
Vorhersagen wurden für diese Stoffe Einstufungs- und
Kennzeichnungsvorschläge erarbeitet (Tyle et al., 2002). Im Gegensatz
dazu verwenden japanische Behörden (METI, MHWL) keine Analogien oder
(Q)SAR-Betrachtungen bei der Beurteilung der toxikologischen
Eigenschaften von neuen Chemikalien.
Zur Erhöhung der Akzeptanz von (Q)SAR-Systemen und zur Minimierung des
fehlerhaften Einsatzes von solchen Systemen wurden auf dem von
CEFIC/ICCA organisierten internationalen Workshop Akzeptanzkriterien
für Vorhersagemodelle entwickelt (CEFIC, 2002; Jaworska et al., 2003).
Eine Validierung verlässlicher Modelle entsprechend diesen sogenannten
Setubal-Kriterien wird als Voraussetzung für eine Verwendung im
regulatorischen Bereich angesehen.
Validitäts-/Akzeptanzkriterien für Vorhersagemodelle/(Q)SARs sind:
Sie beschreiben einen definierten toxikologischen Endpunkt
Sie verwenden einen eindeutigen und einfach anzuwendenden Algorithmus
Sie sind idealer Weise mechanistisch basiert
Sie weisen einen definierten Anwendungsbereich auf ("domain of applicability")
Sie beinhalten ein Maß für die Datenqualität der zugrundliegenden Datenbasis
Die Vorhersagekraft wurde in einer externen Validierung ermittelt
Zur Zeit führt ECVAM2 ein Validierungsprogramm entsprechend den
Setubal-Kriterien mit den verfügbaren Vorhersagemodellen durch (ECVAM,
2004). Keines der kommerziell verfügbaren Vorhersagesysteme erfüllt
derzeit alle der aufgelisteten Kriterien.
Computergestätzte Vorhersagesysteme stellen jedoch in jedem Falle
bereits heute eine sinnvolle Ergänzung des toxikologischen Repertoires
für die Bewertung von Substanzen dar, die sich auf Grund der
vorhandenen geringen Menge oder auf Grund schwieriger Synthese einer
experimentellen Prüfung entziehen (z.B. Verunreinigungen von
Arzneimitteln). Darüber hinaus können sie Hilfestellung beim Screening
und bei der Priorisierung von Substanzen geben, wie dies im Rahmen des
europäischen REACH-Programmeserforderlich wird. Es ist zu erwarten,
dass die bei der Datensammlung im Rahmen des REACH-Programms
anfallenden neuen Datensätze für eine Verbreiterung der Datenbasis und
damit für eine Anhebung der Vorhersagekraft bestehender QSAR-Programme
genutzt werden können.
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